一、 什么是内毒素？
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
所有能引起热原反应的物质被称为热原，药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不全等于细菌内毒素。
二、 细菌内毒素的理化性质
• 耐热性：彻底灭活需250 ℃高温干烤一小时。
• 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。
• 不挥发性
• 被吸附性：可被活性碳吸附。
• 被酸碱破坏：0.1M HCl 或 0.1M NaOH 浸泡4小时。
• 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏。
三、器皿中内毒素的去除：
a.干热法
• 适用对象 ： 耐热物品如玻璃制品、金属制品等生产过程中所用的容器。
• 处理方法 ：180℃3～4h 或 250℃ 30min～2h。
• 注意事项 ：
• 1. 在干烤前，被加热的玻璃器皿上最好不要有水珠，否则可能会使玻璃器皿损坏。
• 2.烘烤结束后，玻璃器皿不要马上从电热烘箱中拿出，要等温度适度降低之后才可以拿出，以免因温差太大而造成玻璃器皿损坏。
• 3.器皿上不能含有纸质或塑料制品，以免烘烤时燃烧或熔化。
b.化学降解法
• 适用对象 ：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素。
• 处理方法 ：常用3～5％双氧水、重铬酸钾硫酸清洁液（重铬酸钾∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。一般处理4h以上。
• 注意事项 ：佩戴防护用具，防止皮肤直接接触。
四、 溶液中内毒素的去除
方法 |
原理 |
优点 |
缺点 |
液相分离法 |
一些去污剂，如Triton X-114，脱氧胆酸钠能够和内毒素的脂质部分结合，通过液相分离的方法萃取内毒素从而使后者有效地去除。 |
对内毒素的去除率高，且不影响有效成份的活性。该法简单高效、价格低廉、适合大规模应用，在我们日常的蛋白纯化中较为常用。 |
去内毒素后的样品会有微量去污剂的残留。 |
分子筛法 |
分子筛是利用凝胶的网状结构，根据分子大小进行分离的一种方法。由于蛋白质和内毒素的分子量有较大差别，因此利用分子筛可以有效去除内毒素。 |
去除效果明显 |
每次处理量小，处理时间较长。 |
离子交换色谱法 |
当溶液pH＞2时，内毒素带有负电荷。因此内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。柱上的内毒素可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。 |
成本低，吸附容量大 |
但不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。 |
亲和色谱法 |
将适当的配基固载于色谱基质上合成出亲和介质，使它特异性结合内毒素。GenScript将多粘菌素B（PMB）偶联于Sepharose FF 上，以此介质特异性吸附内毒素。 |
高效能、高选择性 |
相对成本较高。 |
超滤法 |
由于内毒素具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除溶液中的内毒素。 |
操作简单，处理量大 |
操作过程中的压力较高。 不适合含有较大相对分子质量成份的样品。因为在除去热原的同时会阻留或吸附样品中的有效成份，使产品收率大受影响。 |
吸附法 |
活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的相对分子质量较大。适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中去除内毒素。活性炭常用量为0.1%～0.5%。 |
成本低，处理量大。 |
活性炭的选择性较差，易吸附有效成份，纯化后溶液中的残余活性炭不易去除，且自身可能含有的重金属造成样品污染，因此目前很少使用 |
蒸馏法 |
此方法可用于生产去热源水，作为注射用水或洗涤水 。 |
去除效果明显 |
成本较高 |
疏水层析法 |
内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性， 但在高盐下会凝集， 无法挂上疏水层析柱。因此可选择能结合目标蛋白的疏水介质去除内毒素 |
适用于高盐浓度的样品 |
目前技术不够成熟，还需要进一步探索 |
但是，各种去内毒素的方法不是孤立的，可以相互结合使用。 比如，如果液相分离法得到的蛋白内毒素水平未达标，可以接着利用分子筛法进一步去除内毒素。
五、 作为目前去内毒素常用的方法，液相分离法的注意事项值得我们重视。
1.液相分离方法应用于蛋白纯化中内毒素的去除
a.目的蛋白上样后，用预冷的基础溶液+1% Triton X-114缓慢淋洗柱子，直至A280数值稳定不变；
b.用预冷的去内毒素基础溶液淋洗柱子，直至A280数值达到基线，稳定不变；
c.用各梯度去内毒素的洗脱液洗脱，收集各洗脱液于去内毒素的收集管中；
d.此方法适用广泛，如我们常用Ni柱、GST柱和离子交换柱等纯化；
e.纯化过程应尽量在洁净的环境下进行，纯化时间不宜过长；
f.所用的吸管、枪头等器材应为经去内毒素处理的。
2.液相分离法应用于大量样品中内毒素的去除
a.在大量蛋白样品中加入终浓度为 1% 的Triton X-114 ，充分混匀 ，冰浴 5min ，使之成为一相 ；
b.升温超过其浊点 21 ℃，37 ℃孵育 ，观察分层情况；
c.待溶液中出现明显分层后 ，室温下 12000r/min ，离心5min ，吸取上清液 ；
d.为达到较好的去除效果，可以重复 2 次；
e.如果样品内毒素含量较高，可以提高Triton X-114浓度至2%；
f.如果升温至37 ℃后，分层不明显或比较慢，可以升温至56 ℃孵育；
g.本方法不适用于去除膜蛋白中的内毒素。
六、去内毒素试剂的配置
a.在溶解前将固体试剂用180 ℃烘4-5h，以去除试剂中的水分和内毒素。此法适用于试剂的熔点高于180 ℃ 。若试剂熔点低于180 ℃，常使用80 ℃烘过夜。
b. 去内毒素的水溶解烘过的试剂，定容，调节pH。
c.检测所配置试剂的内毒素含量是否达标，通常为0.01EU/ml。
常见的熔点低于180 ℃或高温分解的试剂：
1.Tris （168-172℃）2.尿素（ 132.7℃ ）3. 咪唑（89-91 ℃） 4.甘油（ 17.8℃ ）5.EDTA（150 ℃ 脱羟基）6.SDS（165 ℃ ）7.肌氨酸钠（ 120℃ ）
常见的需烘烤后才加入的试剂：（危险品，挥发性气味）
1.DTT（42-43 ℃ ）2.β-巯基乙醇（<-100 ℃ ） |
